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抗原制备步骤

发布时间:2019-07-12 14:50:46 | 来源:

以每次制备5个疫苗(偶联OV)为例:

1. 称取0.3g OV,溶解于5ml 0.1M Na2CO3。彻底溶解后于12000rpm离心2min,转上清到洁净的50mL离心管,加入1mL冷丙酮,冷却到4度后备用。

2. 称取75 mg NHS-活化碘乙酸酯 (考虑杂质,用75mg) ,加入300µL的 DMF(富马酸二甲脂),彻底溶解后于10000rpm离心1min,取上清备用,同时留沉淀备用。

3. 边涡旋边逐滴将步骤2的上清液慢慢滴入步骤1的上清液(OV液),转速不能过大,避免起气泡。

4. 在步骤2的沉淀中再次加入100µL的DMF,重悬后于10000rpm离心1min。取上清重复3一次。

5. 将步骤4得到的OV-碘乙酸混合物(pH>9)放到4度,避光孵育15分钟 (每隔5分钟摇晃一次)。

6. 离心后,OV-碘乙酸混合物(6 mL)过脱盐柱(40 mL),方法为:将OV-碘乙酸混合物(大概6mL)均匀滴加到脱盐柱表面,同时计量流出液空量。补加PBS维持液面。弃掉前面15mL空量体积,收集10mL滤液(OV大约25mg/mL),按2mL/管分装备用。【注意每次均需现配现用】

7. 按1 mL比5mg多肽比例,在5管多肽中各加入约1mL【0.1M Na2CO3+10mM EDTA】,混匀溶解。

8. 将步骤7准备好的多肽,按每种多肽(5mg/mL)加入到步骤6分装好的2mL脱盐OV-碘乙酸混合物,混匀。【测PH,PH必须大于7;注意步骤7和8要一管一管的做。】

9. 摇床上低速摇动1小时后,加入4倍体积(12mL)的冰冻丙酮,4度沉淀蛋白质30分钟。

10. 6000rpm离心10分钟,去上清(另外保留,备ELISA检测用),沉淀加入50mL蒸馏水,将抗原稀释成1mg/mL(沉淀部份也是疫苗)。分装冻存备用(制备注射前注意把沉淀也包含在内)。

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