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ELISA实验步骤

发布时间:2019-07-12 14:50:01 | 来源:

第一天: 抗原固定(包埋)

1. 抗原固定(包埋):将对应疫苗用0.05M的碳酸钠(Na2CO3)溶液稀释至2 微克/毫升, 在96孔ELISA薄板上每孔加100µL, 于37度2小时或4度冰箱过夜。第二天

2. 封闭(BLOCKING):用PBSt冲洗薄板三次,每次必须把孔中液体拍掉. 再在每孔加1%脱指奶粉或BSA或0.1%吐温(用PBSt稀释)100µL,37度下放置30分钟.

3. 用PBSt冲洗薄板3次,拍干孔中液体。

4. 滴度测试,每个样本用8孔测试。

(1)如样本为血清,则每孔加上100µL含5µg/mL抑制疫苗(用0.1%BSA的PBSt液稀释),抑制疫苗为偶联物和要检测抗体的疫苗的偶联物一样的另一种疫苗。

(2)如样本为已纯化的抗体,则不用加抑制疫苗。

5. (1)血清样本用含5µg/mL抑制疫苗溶液(用0.1%BSA的PBSt液稀释)稀释400倍.在第一孔加100µL(总量为200µL/孔),混匀后移液100µL到第二孔,同样混匀后从第二孔移液100µL到第三孔•••••如此直至第7孔,留第八孔为空白对照。这样从1-7孔的最终样本稀释度分别为:1:800,1:1600,1:3200, 1:6400, 1: 12800, 1: 25600, 1: 51200。(2)抗体样本则稀释1000倍,混匀后移液50µL到第二孔.....至第七孔,留第八孔为空白对照。

6. 稀释完后在37度反应60分钟.

7. 吸掉每孔中的液体,用PBSt分别清洗4次,每次拍干孔内液体.

8. 上二抗:将抗兔IgG HRP用PBSt稀释,稀释倍数(1:5000-1:20000不等)由其浓度决定,每孔加100µL,37度反应30分钟后重复清洗步奏4次。

9. 拍干后每孔加入100µL的过氧化物酶(HRP)底物TMB生色. 37度大概15-30分钟每孔加100µL2M硫酸终止反应,然后在酶联测试仪于波长450纳米读数.

10. 结果判断、记录:计算OD为50%时,血清(或抗体)的最大稀释度,以最大稀释度为样品的滴度,记录滴度,并将实验结果报告相关人员。

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