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偶联抗体的亲和填料检测步骤

发布时间:2019-07-12 14:49:10 | 来源:

1.清洗填料:取Anti-ACK-agarose100µL, 用1mL的PBSt洗(用移液枪将填料吹匀)3000转/分离心去上清,重复3次,再用1mL 的PBS洗1次离心去上清。

2.与抗原结合:加100µL的ACK-OV(1mg/mL),4度放置30min,用1mL 的PBST洗(用移液枪将填料吹匀)3000转/分离心去上清,重复2次。

3.洗脱抗原:加40µL0.1M HCl混匀,在室温静置5min,得抗原洗脱液,加入60µL0.1M Na2CO3中和,混匀,加入100µL0.05M Na2CO3,混匀,3000转/分离心,取上清包被。

4.稀释上清液:取50µL的上清液稀释于100µL0.05M Na2CO3,即上清液稀释3倍,抗原洗脱液稀释了15倍。

5.包被:取一条酶标条,每孔先加入100µL0.05M Na2CO3,在第一孔加入100µL稀释后的上清液,然后按2倍系列稀释,依次得出抗原洗脱液稀释度分别为1/30,1/60,1/120,1/240,1/480, 1/960, 1/1920,最后1孔设空白,37度静置1h,

6.用PBSt洗酶标条3次,每次拍净。

7.用1%的BSA37℃封闭30min;用PBSt洗酶标条3次,每次拍净。

8.ACK-HRP用0.1%的BSA+PBST+0.1%HRP稳定剂稀释后,每孔加100µL,弹匀,37度反应30分钟,PBST洗4次,每孔加100µLTMB显色5-10分钟,每孔加100µL,2M硫酸终止,在450nm读数,滴度大于1/500为合格。

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