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1.清洗填料：取Anti-ACK-agarose100µL, 用1mL的PBSt洗（用移液枪将填料吹匀）3000转/分离心去上清，重复3次，再用1mL 的PBS洗1次离心去上清。
2.与抗原结合：加100µL的ACK-OV（1mg/mL），4度放置30min，用1mL 的PBST洗（用移液枪将填料吹匀）3000转/分离心去上清，重复2次。
3.洗脱抗原：加40µL0.1M HCl混匀，在室温静置5min,得抗原洗脱液，加入60µL0.1M Na2CO3中和，混匀，加入100µL0.05M Na2CO3，混匀，3000转/分离心，取上清包被。
4.稀释上清液：取50µL的上清液稀释于100µL0.05M Na2CO3,即上清液稀释3倍，抗原洗脱液稀释了15倍。
5.包被：取一条酶标条，每孔先加入100µL0.05M Na2CO3,在第一孔加入100µL稀释后的上清液，然后按2倍系列稀释，依次得出抗原洗脱液稀释度分别为1/30,1/60，1/120，1/240,1/480, 1/960, 1/1920,最后1孔设空白，37度静置1h，
6.用PBSt洗酶标条3次，每次拍净。
7.用1%的BSA37℃封闭30min；用PBSt洗酶标条3次，每次拍净。
8.ACK-HRP用0.1%的BSA+PBST+0.1%HRP稳定剂稀释后，每孔加100µL,弹匀，37度反应30分钟，PBST洗4次，每孔加100µLTMB显色5-10分钟，每孔加100µL，2M硫酸终止，在450nm读数，滴度大于1/500为合格。
