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免疫印迹实验步骤

发布时间:2019-07-12 14:48:30 | 来源:

一 SDS-PAGE电泳(跑胶:蛋白质分离)

1 制胶:

按配方配制凝胶。根据分子量大小选择合适浓度的分离胶:5-7%的分离胶可转移29-150kda, 8-10%用于小于14-66kda,18-20%用于小于20kDa的SDS变性蛋白质,转移效率约100%。

灌分离胶:

两块板约需15mL。装好凝胶灌胶装置,加入蒸馏水放置5分钟,检查是否漏水。不漏,倒去水,滴干,开始灌胶。

戴上手套(因聚丙烯酰胺Acrylamide,过硫酸铵,TEMED试剂有毒),按组分别在烧杯中加入各种试剂(上述三种存于冰箱,TEMED为促凝剂),用注射器(加样器)混匀,然后将分离胶液体从顶部沿侧边注入,液面超过中间分隔板些许,加完双面后左右晃动一下,使液面平整。在沿边壁轻放入90%异丙醇,让凝胶静置30min以上。倒去90%异丙醇,用双蒸馏水洗涤2-3次,剪下小滤纸吸干夹层中的水,再灌浓缩胶。

通常不能形成整齐凝胶的原因是过硫酸铵或TEMED有问题或两者都有问题。

灌浓缩胶:

两块板约需5mL,按组分在烧杯中加入各种试剂(上述三种存于冰箱,TEMED为促凝剂),用注射器(加样器)混匀,然后将浓缩胶液体从顶部沿侧边注入,液面几乎充满夹层,插入梳子胶全部充满夹层,室温静置40min以上。

保荐备用:用保鲜膜将整个装置密封,置冰箱4℃保存,可在一周内使用。

2 加电极液及加样:

选取合适浓度的已灌胶(上层为积层胶即浓缩胶,下层为分离胶)的电泳装置,取下玻璃平板夹层,小心拔出teflon梳子,避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶加样孔(碰歪可用最小bir头或针拔正)。重新放入电泳槽内(注意:玻璃夹板凹面向里,灌胶时向外),先往加样槽内加满1×SDS电极缓冲液,然后小心往加样孔加样,加样量见免疫印迹试验记录表,加完样后,在电泳装置内槽加入1×SDS电极缓冲液,使液面高于夹板凹面接近最高面,并且外槽也要加电极液(上次的内槽电极液:重复利用)。

3 电泳:

加完样(加样量以每孔30-50µg为准)后装上电极(装置外用冰袋降温)开始电泳(蛋白质分离):先设定80v电压电泳,当指示剂(溴酚蓝)泳动到分离胶界面(蛋白质通过浓缩胶层)时约40min,待指示剂(溴酚蓝)接近分离胶底时(约需2h)电泳结束。

电泳为恒压电泳。

二 膜转移(半干转移):

1 切胶:

戴上乳胶手套(进行接触滤纸,凝胶和膜的操作时,应戴手套,因为手上的油脂会阻断转印),取下电泳玻璃夹板,小心分开夹板,把浓缩胶用分离胶多余部分切除,按胶的尺寸大小再剪取硝酸纤维素膜(NC膜)二张用八张滤纸(可先剪好)

2 泡胶: 将上述切好的凝胶块,NC膜,滤纸在半干电转缓冲液中浸泡15分钟。

3 装槽: 在半干转移的支持垫上按双层滤纸→分离胶→NC膜→双层滤纸的顺序叠放,用湿玻棒轻轻滚过,排尽气泡(各层之间不能有气泡),凝胶靠近负极,而NC膜靠近正极。

4 半干转移:

盖上半干转移槽盖,夹紧,插上电极电源,设定电流100mA,转移约35min, (分子量越大,时间越久,也可150mA,30min,大分子量,电流调大转移快些,小分子量,电流调大,易转移过头)。整个转移槽组合顺序为:负极→支持垫→滤纸→分离胶→NC膜→滤纸→支持垫→正极

5 洗膜:

转移完毕,先用蒸馏水冲洗,再将NC膜放放已盛有TBST(TBS+0.05%的吐温)的培养皿中在摇床约4min。

6 做好标记:

根据多肽分子量标准混合物溶液(混MK)在NC膜上显示的蓝色带在膜上压出压痕—即混合M的分子量的标线:96kd,70kd,45kd,32kd,18kd

7 封闭:

在培养皿中加入适量体积10-15mL的含5%的脱脂奶粉的TBST(或含3%BSA,或用TBST与猪血清1:1溶液),放入NC膜,室温下摇动封闭30分钟以上,用胶膜盖好培养皿,置胶膜盖好培养皿,置冰箱中过夜(主要是接着做时间不够)。

8 上一抗:

将NC膜TBST洗涤摇洗3次,每次5分钟。

取培养皿10个,编号:11#,12#,13#,14#,15#,21#,22#,23#,24#,25#(11#,21#分别表示第一,二块大膜的第一,二块大膜的第一,二小块….)。在每个皿放2mL含0.5%的脱脂奶粉(或含0.1%BSA)的TBST溶液,按编号按浓度(见记录表)要求加入一抗,在摇床上先10-20分钟,再将NC膜剪开按编号加入皿中,于室温在摇床上杂交2小时

9 洗涤:

用TBST洗涤NC膜4次,每次10分钟

10 上二抗:

用试管将二抗(全部用羊抗兔IgG-HRP:因上述213,213-P,214,214-P均为由兔血生产的抗体)按1:5000(10µLIgG加TBST50mL)用含0.1%BSA的TBST溶液稀释到50mL,每个皿放入5mL,放入NC膜(为节省IgG,可全部集中一个稍大的培养皿中,加20mL含0.1%BSA的TBST溶液)于室温在摇床上杂交1小时。

11 洗涤:

用TBST洗涤NC膜4次,每次10分钟

12 准备显色:

准备好剪刀一把,镊子一把,X胶片,适量显影液,适量显影液,适量定影液,TIP头和相应的移液枪,暗盒,透明塑料片。

上发光液: 将膜按编号顺次排在硬塑料夹中,按1:1配制好ECL发光液各500µL,在暗房内将配好的发光液ECL1mL滴到NC膜上,并确保发光液均匀布在膜上,反应3-5分钟。

曝光:关照明灯,迅速取出合适胶片压在NC膜隔一层薄膜上(注意位置),盖紧暗盒,曝光1-10分钟(视具体情况定)

显影:转移到显影液中,轻轻晃动使显影均匀,直到能看见见黑色的条带(约10-15秒)

定影:迅速将X胶片过一次蒸馏水,然后转移到定影液中,轻轻晃动定影液定影。

冲洗:用自来水将经过定影处理的X胶片洗净,晾干,记录,保存实验结果。

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