免疫印迹实验步骤

一 SDS-PAGE电泳（跑胶：蛋白质分离）

1 制胶：

按配方配制凝胶。根据分子量大小选择合适浓度的分离胶：5-7%的分离胶可转移29-150kda, 8-10%用于小于14-66kda，18-20%用于小于20kDa的SDS变性蛋白质，转移效率约100%。

灌分离胶：

两块板约需15mL。装好凝胶灌胶装置，加入蒸馏水放置5分钟，检查是否漏水。不漏，倒去水，滴干，开始灌胶。

戴上手套（因聚丙烯酰胺Acrylamide，过硫酸铵，TEMED试剂有毒），按组分别在烧杯中加入各种试剂（上述三种存于冰箱，TEMED为促凝剂），用注射器（加样器）混匀，然后将分离胶液体从顶部沿侧边注入，液面超过中间分隔板些许，加完双面后左右晃动一下，使液面平整。在沿边壁轻放入90%异丙醇，让凝胶静置30min以上。倒去90%异丙醇，用双蒸馏水洗涤2-3次，剪下小滤纸吸干夹层中的水，再灌浓缩胶。

通常不能形成整齐凝胶的原因是过硫酸铵或TEMED有问题或两者都有问题。

灌浓缩胶：

两块板约需5mL,按组分在烧杯中加入各种试剂（上述三种存于冰箱，TEMED为促凝剂），用注射器（加样器）混匀，然后将浓缩胶液体从顶部沿侧边注入，液面几乎充满夹层，插入梳子胶全部充满夹层，室温静置40min以上。

保荐备用：用保鲜膜将整个装置密封，置冰箱4℃保存，可在一周内使用。

2 加电极液及加样：

选取合适浓度的已灌胶（上层为积层胶即浓缩胶，下层为分离胶）的电泳装置，取下玻璃平板夹层，小心拔出teflon梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶加样孔（碰歪可用最小bir头或针拔正）。重新放入电泳槽内（注意：玻璃夹板凹面向里，灌胶时向外），先往加样槽内加满1×SDS电极缓冲液，然后小心往加样孔加样，加样量见免疫印迹试验记录表，加完样后，在电泳装置内槽加入1×SDS电极缓冲液，使液面高于夹板凹面接近最高面，并且外槽也要加电极液（上次的内槽电极液：重复利用）。

3 电泳：

加完样（加样量以每孔30-50µg为准）后装上电极（装置外用冰袋降温）开始电泳（蛋白质分离）：先设定80v电压电泳，当指示剂（溴酚蓝）泳动到分离胶界面（蛋白质通过浓缩胶层）时约40min，待指示剂（溴酚蓝）接近分离胶底时（约需2h）电泳结束。

电泳为恒压电泳。

二 膜转移（半干转移）：

1 切胶：

戴上乳胶手套（进行接触滤纸，凝胶和膜的操作时，应戴手套，因为手上的油脂会阻断转印），取下电泳玻璃夹板，小心分开夹板，把浓缩胶用分离胶多余部分切除，按胶的尺寸大小再剪取硝酸纤维素膜（NC膜）二张用八张滤纸（可先剪好）

2 泡胶： 将上述切好的凝胶块，NC膜，滤纸在半干电转缓冲液中浸泡15分钟。

3 装槽： 在半干转移的支持垫上按双层滤纸→分离胶→NC膜→双层滤纸的顺序叠放，用湿玻棒轻轻滚过，排尽气泡（各层之间不能有气泡），凝胶靠近负极，而NC膜靠近正极。

4 半干转移：

盖上半干转移槽盖，夹紧，插上电极电源，设定电流100mA,转移约35min, (分子量越大，时间越久，也可150mA，30min,大分子量，电流调大转移快些，小分子量，电流调大，易转移过头)。整个转移槽组合顺序为：负极→支持垫→滤纸→分离胶→NC膜→滤纸→支持垫→正极。

5 洗膜：

转移完毕，先用蒸馏水冲洗，再将NC膜放放已盛有TBST(TBS+0.05%的吐温)的培养皿中在摇床约4min。

6 做好标记：

根据多肽分子量标准混合物溶液（混MK）在NC膜上显示的蓝色带在膜上压出压痕—即混合M的分子量的标线：96kd,70kd,45kd,32kd,18kd。

7 封闭：

在培养皿中加入适量体积10-15mL的含5%的脱脂奶粉的TBST（或含3%BSA，或用TBST与猪血清1：1溶液），放入NC膜，室温下摇动封闭30分钟以上，用胶膜盖好培养皿，置胶膜盖好培养皿，置冰箱中过夜（主要是接着做时间不够）。

8 上一抗：

将NC膜TBST洗涤摇洗3次，每次5分钟。

取培养皿10个，编号：11#，12#，13#，14#，15#，21#，22#，23#，24#，25#（11#，21#分别表示第一，二块大膜的第一，二块大膜的第一，二小块….）。在每个皿放2mL含0.5%的脱脂奶粉（或含0.1%BSA）的TBST溶液，按编号按浓度（见记录表）要求加入一抗，在摇床上先10-20分钟，再将NC膜剪开按编号加入皿中，于室温在摇床上杂交2小时。

9 洗涤：

用TBST洗涤NC膜4次，每次10分钟

10 上二抗：

用试管将二抗（全部用羊抗兔IgG-HRP：因上述213，213-P，214，214-P均为由兔血生产的抗体）按1：5000（10µLIgG加TBST50mL）用含0.1%BSA的TBST溶液稀释到50mL,每个皿放入5mL,放入NC膜（为节省IgG,可全部集中一个稍大的培养皿中，加20mL含0.1%BSA的TBST溶液）于室温在摇床上杂交1小时。

11 洗涤：

用TBST洗涤NC膜4次，每次10分钟

12 准备显色：

准备好剪刀一把，镊子一把，X胶片，适量显影液，适量显影液，适量定影液，TIP头和相应的移液枪，暗盒，透明塑料片。

上发光液： 将膜按编号顺次排在硬塑料夹中，按1：1配制好ECL发光液各500µL，在暗房内将配好的发光液ECL1mL滴到NC膜上，并确保发光液均匀布在膜上，反应3-5分钟。

曝光：关照明灯，迅速取出合适胶片压在NC膜隔一层薄膜上（注意位置），盖紧暗盒，曝光1-10分钟（视具体情况定）

显影：转移到显影液中，轻轻晃动使显影均匀，直到能看见见黑色的条带（约10-15秒）

定影：迅速将X胶片过一次蒸馏水，然后转移到定影液中，轻轻晃动定影液定影。

冲洗：用自来水将经过定影处理的X胶片洗净，晾干，记录，保存实验结果。